本发明公开了一种利用黄花牛耳朵叶片快速繁殖其种苗的方法，通过对其外植体进行初代培养、继代培养和炼苗移栽，经“初代培养→继代培养”两步法直接成苗，可在90天左右繁殖获得大量健壮小苗，无需经过生根阶段，而且继代培养不需添加激素，不仅减少了生产环节，而且降低了生产成本，实现黄花牛耳朵有效繁殖。本方法不仅取材方便，不会影响黄花牛耳朵野生种群的数量；而且操作简单、生产成本低、稳定高效，能大大缩短育苗周期，将为其保护和开发利用提供技术保障。
1.xa0一种利用黄花牛耳朵叶片快速繁殖其种苗的方法，包括如下步骤：（1）外植体处理：取黄花牛耳朵叶片为外植体，用清水洗去其表面的尘土，将其放入50%多菌灵可湿粉剂1g/L+抗坏血酸0.8g/L+青霉素100xa0IU/Lxa0+链霉素100μg/L配成的混合消毒液中浸泡15~20min，洗洁精水洗1xa0min，流水冲洗15~20min；转移到超净工作台中，用75%酒精浸泡6~10s，无菌水冲洗2~3次，再用0.1%升汞溶液浸泡消毒7~10min，无菌水冲洗3~4次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面水分；（2）外植体的初代培养：将处理后的外植体用解剖刀切成1.5cm×1.0cm的小块，在超净工作台中晾4~6min，接种于MS+TDZ0.1mg/Lxa0+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/Lxa0+xa0蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，xa0pH5.8的培养基中，培养50天，培养温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000~3000lx；（3）继代培养：经初代培养后，叶片边缘、表面诱导产生大量小苗，将小苗接入MS+0.1%活性炭+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，pH5.8的培养基中培养，培养温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000~3000lx；继代3天开始有根发生，培养35~40天长成完整健壮小苗，株高2-3cm，根的数目为8-20根；（4）炼苗与移栽：待黄花牛耳朵小苗株高2~3cm时，打开培养瓶盖，在室温下炼苗7天后，将小苗移栽至珍珠岩:蛭石＝1:1混合的基质中。技术领域
xa0本发明涉及对珍稀濒危植物黄花牛耳朵的离体快速繁殖方法，具体是以黄花牛耳朵叶片为外植体进行组织培养，获得试管苗，属于生物技术领域。
背景技术
黄花牛耳朵(Chiritaxa0lutea)是广西特有的苦苣苔科(Gesneriaceae)植物，有清肺止咳，补虚止血的功效。可治肺结核，咳喘，吐血，红崩白带症。目前，仅发现在广西贺州市一些区域的石灰岩石山上分布。由于产区群众的随意采挖，加上石灰岩地区生态环境持续恶化等外界因素影响，以及自身自然繁殖能力低弱、致使黄花牛耳朵野生种群个体数量逐年减少，急需进行保护。同时该种还具有极高的观赏价值和育种价值，其花色为属内组间罕见的暖色调—黄色，且花量大，花期较长，对室内环境适应性良好，极具室内观赏盆花开发前景。现有文献“黄花牛耳朵的离体培养和快速繁殖”作者温放、张启翔、任翔翔，《植物生理学通讯》，2008年4月第44卷第2期，公开了用黄花牛耳朵的花梗、苞片和幼嫩花蕾为外植体进行组织培养，获得试管苗的方法。但其外植体属于生殖器官，必须花期取材，不容易获得。另外直接采用繁殖器官进行离体快繁，也不利于黄花牛耳朵野生种群的繁衍和更新。文献中黄花牛耳朵再生植株诱导途径为：愈伤组织——不定芽诱导——愈伤组织——不定芽扩繁，整个过程需经过愈伤组织阶段，愈伤组织的诱导率为55~76%，为间接器官发生途径，容易产生变异，不利于黄花牛耳朵的种质保存。本发明采用外植体为黄花牛耳朵叶片，为营养器官，一年四季均可取材，取材方便，亦不会影响野生种群数量。因此，以黄花牛耳朵叶片为外植体建立其快速繁殖技术，为该物种的资源保护和可持续开发利用奠定基础。目前以黄花牛耳朵叶片为外植体进行快速繁殖的技术尚未见报道。
发明内容
u3000本发明的目的是针对黄花牛耳朵野生资源稀少，提供一种利用黄花牛耳朵叶片快速成苗离体快繁的方法，经“初代培养→继代培养”两步法直接成苗，建立一套关于黄花牛耳朵的简单、快速、有效的繁殖体系。本方法不仅取材方便，不会影响黄花牛耳朵野生种群的数量；而且操作简单、生产成本低、稳定高效，能大大缩短育苗周期，将为其保护和开发利用提供技术保障。一种利用黄花牛耳朵叶片快速繁殖其种苗的方法，包括如下步骤：xa0xa0xa0（1）外植体处理：取黄花牛耳朵叶片为外植体，用清水洗去其表面的尘土，将其放入50%多菌灵可湿粉剂1g/L+抗坏血酸0.8g/L+青霉素100xa0IU/Lxa0+链霉素100μg/L配成的混合消毒液中浸泡15~20min，洗洁精水洗1xa0min，流水冲洗15~20min；转移到超净工作台中，用75%酒精浸泡6~10s，无菌水冲洗2~3次，再用0.1%升汞溶液浸泡消毒7~10min，无菌水冲洗3~4次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面水分；（2）外植体的初代培养：将处理后的外植体用解剖刀切成1.5cm×1.0cm的小块，在超净工作台中晾4~6min，接种于MS+TDZ0~0.1mg/Lxa0+6-BA0.1~0.5mg/L+NAA0.05~0.5mg/Lxa0+xa0蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，xa0pH5.8的培养基中，初代培养50天，培养温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000~3000lx；（3）继代培养：经初代培养后，叶片边缘诱导产生大量小苗，将小苗接入MS+0.1%活性炭+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，pH5.8的培养基中培养，培养温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度2000~3000lx；继代3天开始有根发生，培养35~40天长成完整健壮小苗，株高2-3cm，根的数目为8-20根；xa0（4）炼苗与移栽：待黄花牛耳朵小苗株高2~3cm时，打开培养瓶盖，在室温下炼苗7天后，将小苗移栽至珍珠岩:蛭石＝1:1混合的基质中。进一步的，步骤（2）所述培养基的优选为：MSxa0+TDZ0.1xa0mg/L+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/Lxa0+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L。更进一步的，步骤（2）所述培养基的优选为：MSxa0+6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L。本发明与现有技术相比的优点在于：1、本发明利用黄花牛耳朵叶片为外植体，外植体容易获得，不影响自然种群的数量。2、本发明经“初代培养诱导丛生不定芽→不定芽继代培养”xa0两步法，只需更换一次培养基，不需经过生根培养，仅需90天左右即可繁殖获得大量健壮小苗，具有生产成本低，繁殖速度快，成苗时间短的优点。3、采用本发明方法，黄花牛耳朵的诱导率为66.7~100%，单个外植体的平均成苗数为55棵，仅需继代一次，且继代培养基不需添加激素，继代3天开始有根发生，培养至40天长成完整健壮小苗，株高2-3cm，根的数目为8-20根。将小苗移栽至珍珠岩和蛭石体积比为1:1的基质中，移栽成活率为100%。4、采用本方法能简单、快速、有效地培育出黄花牛耳朵优质种苗，达到保护该物种的目的。
具体实施方式
xa0xa0xa0xa0下面结合实施例对本发明的内容作进一步说明，但并不是对本发明的限定。xa0xa0xa0xa0实施例1一种利用黄花牛耳朵叶片快速繁殖其种苗的方法，包括如下步骤：（1）外植体处理：取黄花牛耳朵叶片为外植体，用清水洗去其表面的尘土，将其放入50%多菌灵可湿粉剂1g/L+抗坏血酸0.8g/L+青霉素100xa0IU/Lxa0+链霉素100μg/L配成的混合消毒液中浸泡15~20min，洗洁精水洗1xa0min，流水冲洗15~20min；转移到超净工作台中，用75%酒精浸泡6~10s，无菌水冲洗2~3次，再用0.1%升汞溶液浸泡消毒7~10min，无菌水冲洗3~4次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面水分；xa0（2）外植体的初代培养：将处理后的外植体用高温灼烧、冷却后的解剖刀切成1.5xa0cm×1.0xa0cm的小块，在超净工作台中晾5min，接种于MSxa0+TDZ0.1xa0mg/L+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/Lxa0+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，xa0pH5.8的培养基中培养，培养温度25±2℃，光照时间12h·d-1，光照强度2000~3000lx，21d时切口边缘处即开始诱导出丛生小芽，诱导率为100%，培养50天统计增殖率，单个叶片诱导小苗数为30~70棵；xa0（3）继代培养：将黄花牛耳朵小苗接入MS+0.1%活性炭+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，xa0pH5.8的培养基中进行继代培养，培养温度25±2℃，光照时间12h·d-1，光照强度2000~3000lx，3天后小苗陆续诱导出根，继续培养至40天长成健壮小苗，株高2-3cm，根的数目为8-20根；xa0（4）炼苗与移栽：待黄花牛耳朵小苗株高2~3cm时，打开培养瓶盖，在室温下炼苗7天后进行移栽，花盆用50%多菌灵可湿粉剂1g/L溶液浸泡30min；将小苗用50%多菌灵可湿粉剂1000倍液浸泡整株小苗xa010xa0分钟，移栽入经高压灭菌的珍珠岩和蛭石体积比为1:1混合的基质中，30天后统计成活率，成活率为100%。xa0xa0xa0xa0实施例2一种利用黄花牛耳朵叶片快速繁殖其种苗的方法，包括实施例1的方法步骤，与其不同的是：初代培养的外植体接种于MS+TDZ0.1xa0mg/Lxa0+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/Lxa0+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L培养基中。13d时，叶片边缘及外植体表面萌生大量细小芽点，芽在外植体上散在分布，芽健壮嫩绿，诱导率为66.7%。培养50天统计增殖率，单个叶片诱导小苗数为35~80棵。xa0xa0xa0xa0实施例3xa0xa0xa0xa0一种利用黄花牛耳朵叶片快速繁殖其种苗的方法，包括实施例1的方法步骤，与其不同的是：初代培养的外植体接种于MSxa0+6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L培养基中。19d时切口边缘处即开始诱导出小芽，诱导率为100%。培养50天统计增殖率，单个叶片诱导小苗数为55~75棵。xa0xa0xa0xa0下表显示实施例1~3中初代培养时，不同培养基对黄花牛耳朵组培快繁的外植体诱导率、小芽萌动时间、单个外植体诱导小芽数及移栽成活率的影响。 ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="538"/>